背景介紹

近年來，反應數(shù)據(jù)采集、處理和控制的新興技術(shù)已開始將制藥過程開發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)據(jù)日益豐富的科學領(lǐng)域。制藥商已開始采用“工業(yè) 4.0”的精神，其中模擬、系統(tǒng)集成和大型數(shù)據(jù)集的生成是更加關(guān)注質(zhì)量、安全、成本效益和可持續(xù)性的關(guān)鍵推動因素。充分利用這些技術(shù)進步有望在開發(fā)和執(zhí)行化學工藝的速度和可靠性方面取得顯著改善。制藥監(jiān)管機構(gòu)最近發(fā)起的質(zhì)量源于設計 (QbD) 計劃鼓勵制造商基于對反應的透徹理解來設計和控制流程。這一舉措的關(guān)鍵是通過過程分析技術(shù) (PAT) 實時采集化學過程開發(fā)和過程中監(jiān)控的數(shù)據(jù)。

當前，制藥行業(yè)的范式正在從傳統(tǒng)的批量生產(chǎn)轉(zhuǎn)向用于制備活性藥物成分 (API) 的連續(xù)加工，這得到了 PAT 可用性和實施的增加的支持。最近的審查強調(diào)了 PAT 在連續(xù)流環(huán)境中的成功實施。PAT 已在連續(xù)流系統(tǒng)中用于實現(xiàn)過程控制的反饋回路，黑盒優(yōu)化，如實驗設計 (DoE) 和自動自我優(yōu)化，動力學模型鑒別和參數(shù)估計，并指導藥物發(fā)現(xiàn)程序.最常用的實時在線 PAT 工具是 UV/Vis、Raman、IR、和NMR。最近，它們的使用變得越來越流行，部分原因是臺式設備和流通池的商業(yè)可用性增加。此外，還描述了在連續(xù)流動平臺內(nèi)使用集成色譜分析技術(shù)，例如高效/超高效液相色譜 (HPLC/UPLC) 和 GC。然而，在這些情況下，通常需要在進樣前進行額外的樣品制備。在學術(shù)和工業(yè)實驗室中，離線執(zhí)行所有這些分析技術(shù)仍然很常見。在這些情況下，樣品制備會浪費時間，并且分析的樣品并不總是代表反應性能。與僅使用離線分析的情況相比，利用實時分析的流程將導致更快且通常更可靠的流程優(yōu)化。

上述示例表明，在連續(xù)流系統(tǒng)中集成單個分析儀器以分析單步反應現(xiàn)在在連續(xù)處理社區(qū)中已經(jīng)很好地建立起來。然而，流動化學的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是能夠在集成的連續(xù)流動系統(tǒng)中執(zhí)行復雜的多步驟轉(zhuǎn)換，而無需人工干預。目前，在不中斷的情況下將不同的反應器模塊和分析組合成一個完全集成的連續(xù)過程的先例有限。連續(xù)流技術(shù)通常不靈活，不同步驟之間會出現(xiàn)兼容性問題。使用不同技術(shù)在連續(xù)流系統(tǒng)內(nèi)的多個點進行反應分析對于快速參數(shù)優(yōu)化和有效控制過程性能以完全實現(xiàn)多步轉(zhuǎn)換至關(guān)重要?，F(xiàn)有的多步連續(xù)流轉(zhuǎn)換研究通常在分離的連續(xù)流步驟中使用不同的 PAT 儀器。

精心設計的連續(xù)流反應器已被證明可以顯著提高各種系統(tǒng)的反應性能；特別是那些對混合敏感、高度放熱或涉及短期中間體的產(chǎn)品。因此，由多個離散單元組成的模塊化反應器系統(tǒng)最適合這些應用，因為每個“模塊”都可以優(yōu)化以適應所需的化學反應并重新配置以適應無數(shù)不同的反應系統(tǒng)。

由于其增強的傳熱和傳質(zhì)特性，在微反應器系統(tǒng)中使用有機金屬試劑進行的反應可以觀察到顯著改進，但有機金屬試劑可能會由于反應器通道內(nèi)的水分敏感性和固體形成而帶來重大的處理挑戰(zhàn)。在間歇式反應器中，這種類型的反應通常在低溫下進行，但流動處理可以承受更高的溫度。我們目前的研究興趣使我們研究了多個 PAT 儀器（IR、NMR 和 UPLC）在模塊化流動反應器系統(tǒng)中的集成，以監(jiān)測具有挑戰(zhàn)性的多步有機金屬轉(zhuǎn)化。

2019年4月08日，歐洲著名連續(xù)流專家C. Oliver Kappe教授研究小組的一項成果發(fā)表在Reaction Chemistry & Engineering期刊上（DOI: 10.1039 / C9RE00087A ）。該文章（Laboratory of the future: a modular flow platform with multiple integrated PAT tools for multistep reactions）以在線分析與連續(xù)流化學相結(jié)合，構(gòu)建了有利于工業(yè)4.0的未來實驗室如圖1b所示，并以化合物丙酸叔丁酯在該體系下合成β-羥基丁酸酯類產(chǎn)物為例進行了說明。如圖1a所示。

圖1.  a）反應方案顯示丙酸叔丁酯1的去質(zhì)子化，其與醛親電子試劑3的反應，然后驟冷，得到醛醇產(chǎn)物5；b）本研究中使用的zui終反應裝置示意圖，顯示泵，傳感器（T =溫度傳感器; P =壓力傳感器）和PAT儀器的位置，以及它們與LabVision控制系統(tǒng)的連接（黑色虛線=電信號連接線，藍色虛線=循環(huán)換熱介質(zhì)路線）。

結(jié)果與討論：

第一步是通過用二異丙基氨基鋰（LDA）去質(zhì)子化丙酸叔丁酯1來生成烯醇化物2（圖1a）。然后烯醇化物2與4-氟苯jia醛3反應生成金屬化的中間體4. 隨后用水原位淬滅得到所需產(chǎn)物5. 這類化學物質(zhì)廣泛用于靶向合成相關(guān)藥物。

整個系統(tǒng)包括連續(xù)流反應器，四個進料泵，進料溶液包括：

1. 0.4M底物1和內(nèi)標（聯(lián)苯）在THF中的溶液

2. 0.44M LDA在THF中的溶液

3. 0.48M 4-氟苯甲醛3在THF中的溶液，

4. 水

首先將基質(zhì)1和LDA溶液混合以在1#反應片中形成烯醇化物2，停留時間為約5秒。隨后，將醛3溶液引入2#反應片中，在驟冷之前再反應80秒。驟冷的停留時間相當于約18秒。

將來自1#反應模塊的流出物通過IR流通池進行在線IR分析。然后使反應混合物通過在線流動池（0.8mL內(nèi)部體積），用臺式NMR光譜儀（Spinsolve Ultra 43MHz，Magritek）監(jiān)測。然后引入水以淬滅反應混合物并收集出口混合物。在引入水之后在線進行UPLC分析并通過對分餾的反應器輸出進行取樣來離線。在在線分析的情況下，將工藝流出的樣品轉(zhuǎn)移，然后用H2O / MeCN稀釋。

隨后，將6號通閥（2.6μL注射體積）注入等分試樣的稀釋流到LC柱上。連續(xù)流量設置中的泵和傳感器連接到HiTec Zang LabManager單元，并由LabVision軟件控制。

結(jié)果得到圖2，IR分析圖，圖3，NMR，圖4，UPLC分析圖，可以在反應的不同階段通過儀器實時監(jiān)測反應及時觀察到過程的化學反應和生產(chǎn)。

圖2. 代表性的ReactIR光譜  a）丙酸叔丁酯原料1及其去質(zhì)子化形成烯醇化物2; b）丙酸叔丁酯1和醛親電子試劑3的組合溶液。

圖3. 反應混合物的堆疊NMR光譜

顯示醛3轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物烯醇化物4的程度。使用配備有玻璃流通池的Magritek Spinsolve Ultra 43MHz獲得這些光譜。

圖4. 代表性的UPLC色譜圖顯示了所有測量的反應組分

標記為“極性物質(zhì)”的信號主要由4-氟苯甲酸組成，在醛3中作為次要雜質(zhì)存在。并根據(jù)已有數(shù)據(jù)進行進一步分析得到圖5與圖6，對多步反應判斷更加準確。

圖 5 用于在線 UPLC 分析的連續(xù)二次采樣和稀釋設置的示意圖，通過自動進樣。

UPLC 的更高靈敏度意味著與傳統(tǒng) HPLC 方法相比，它還能耐受低得多的分析物濃度。

壓力和泵送穩(wěn)定性

在反應器系統(tǒng)運行較長時間后，由于試劑輸送不一致而導致挫折，因此紅外跡線顯示脈沖允許保留高達 50% 的丙酸起始材料。當用壓力曲線交叉檢查 IR 數(shù)據(jù)時，發(fā)現(xiàn)這個時間與泵注射器互換相匹配。泵性能由科里奧利質(zhì)量流量控制器測量，以允許對泵參數(shù)進行微調(diào)。在每個單獨的泵的情況下，發(fā)現(xiàn)理想值是不同的，但是一旦校正就提供無脈動操作。

此外，對操作期間獲取的壓力讀數(shù)的分析顯示出不穩(wěn)定的曲線，在某些情況下，由于部分通道堵塞，觀察到壓力增加了 20bar以上。我們認為堵塞是由鋰鹽沉淀引起的。在大多數(shù)情況下，一段時間后，由此產(chǎn)生的壓力增加會解除堵塞，使系統(tǒng)壓力恢復到正常水平。然而，部分堵塞不利于長期反應穩(wěn)定性，加速泵磨損，而且限制試劑流動和抑制混合。最終，將發(fā)生完全阻塞并需要臨時關(guān)閉該過程。在制造環(huán)境中，這種類型的故障可能需要將大量材料轉(zhuǎn)移到廢物中（尤其是在流程重啟階段），從而導致供應鏈復雜化和資金損失。

對于所有后續(xù)實驗，安裝了具有更寬通道（最小直徑為 0.5 毫米）和更大體積（1.63 毫升）的反應器板。在該反應器配置中，去質(zhì)子化的停留時間變?yōu)榇蠹s 11 秒，并且在淬滅之前添加親電試劑后還有 99 秒。驟冷的停留時間約為 18 秒。使用這個新的反應器板，沒有觀察到進一步的堵塞問題，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的壓力分布。

反應優(yōu)化實驗

結(jié)合所有三種 PAT 儀器，預計大量數(shù)據(jù)將能夠在短時間內(nèi)優(yōu)化反應參數(shù)。這是作為一次一個因素開始的研究，檢查反應溫度（0–40 °C）、醛3負載（1–1.2 當量）和 LDA 負載（1–1.2 當量）的影響.

發(fā)現(xiàn)該過程在 20 °C 下運行最有利。預計升溫至 40 °C 會提高鋰鹽的溶解度并降低沉淀的可能性，但會對產(chǎn)物5 的形成產(chǎn)生不利影響。當考慮到工業(yè)規(guī)模時，在接近環(huán)境溫度下進行通常需要分批低溫條件的有機金屬反應已被證明具有節(jié)省大量能源的潛力。

隨后，使用統(tǒng)計實驗設計軟件包（Modde v11）將優(yōu)化實驗的響應擬合到多項式模型中。通過使用多元線性回歸，根據(jù)醛3和所需產(chǎn)物5的 NMR 和 UPLC 數(shù)據(jù)擬合模型。通過包括所有主要、平方和交互項然后刪除不重要的項來生成模型。R 2值為0.74（3，NMR），0.89（3，UPLC），0.93（5，NMR）和0.84（5，UPLC）的所有模型都實現(xiàn)了良好的擬合。這些模型還顯示出中等至良好的可預測性水平Q 2值為0.50（3，NMR）、0.79（3，UPLC）、0.66（5，NMR）和0.66（5，UPLC）。已證明醛3當量在探索的當量范圍內(nèi)對所需產(chǎn)物5 的產(chǎn)率沒有影響。增加LDA當量顯示出對產(chǎn)物5產(chǎn)率具有積極影響。觀察到溫度影響的負平方項，描述了從 0 到 20 °C 的產(chǎn)量增加5和從 20 到 40 °C 的下降?；谑褂?UPLC 數(shù)據(jù)。這些模型隨后用于探索實驗設計空間（圖 6）。

圖 6 使用離線 UPLC 分析的實驗數(shù)據(jù)擬合的模型預測產(chǎn)品產(chǎn)量的等高線圖。

圖7、橫向擴展運行的反應數(shù)據(jù)  a）總體反應方案，突出顯示量化的物種; b）圖表顯示了不同儀器檢測到的每個物種隨時間的數(shù)量。

在幾乎整個反應期間觀察到酯1的完全去質(zhì)子化，這意味著試劑遞送與任何流速變化的可忽略的影響一致（圖7b，紅線）。當觀察到兩次短暫的干擾時（29和32分鐘），酯1去質(zhì)子化程度降低5％導致產(chǎn)率降低10％，持續(xù)約10分鐘。由這種微小偏差引起的這種顯著影響強調(diào)了該過程對微小變化的敏感性，以及實時反應監(jiān)測的能力。

UPLC分析顯示在整個實驗期間所需產(chǎn)物5的產(chǎn)率為70-85％（圖6b，綠線），與來自先前產(chǎn)生的多項式模型的預測值相對應。然而，NMR監(jiān)測提供了85-90％的前驅(qū)物4的始終較高的值。這種差異被認為是由于通過NMR在所需中間體4與副產(chǎn)物6之間的差的差異引起的。

這種副產(chǎn)物來自于將產(chǎn)物烯醇化物4加入到第二個親電試劑分子中（ESI第4.2節(jié)），并且其在整個反應過程中的增加與醛3的減少相對應。這突出了UPLC作為定量分析技術(shù)的能力，它在眾多化學物種之間的分辨率盡管絕對值存在差異，但兩種技術(shù)觀察到的趨勢基本相同，從而進一步為獲得的數(shù)據(jù)提供了信心。

按比例縮小的連續(xù)流動過程在70分鐘的時間內(nèi)成功運行，通過柱色譜法純化后分離出4.9g所需產(chǎn)物，相當于產(chǎn)率為70％，產(chǎn)率為4.2g h-1。

實驗結(jié)論

本研究已經(jīng)證明了三種不同的在線分析儀器在模塊化反應器系統(tǒng)中的集成，可用于多步有機金屬反應的優(yōu)化和過程監(jiān)測。該模塊化流動反應器可通過多個傳感器和集成控制系統(tǒng)實現(xiàn)實時反應監(jiān)測。

使用在線React IR監(jiān)測LDA對丙酸叔丁酯1的去質(zhì)子化，其中可以清楚地量化酯C = O拉伸的消失。隨后，使用醛質(zhì)子和芳基質(zhì)子作為不同的標記，通過在線NMR監(jiān)測烯醇鋰加入到親電子試劑3中的進程。zui終的反應性能通過在線UPLC量化，通過定制的連續(xù)二次取樣稀釋系統(tǒng)實現(xiàn)。

利用大量數(shù)據(jù)快速探索反應參數(shù)，繪制實驗空間。對于生成的所有多項式模型，獲得了良好的擬合，允許估計每個參數(shù)的小變化將對總體反應性能產(chǎn)生的影響。使用集成傳感器和在線分析來監(jiān)控每個反應步驟，從而擴大了流程。開發(fā)的具有集成PAT的反應器平臺支持數(shù)據(jù)豐富的實驗室環(huán)境，用于實時多步反應監(jiān)測; 對于制藥和精細化工行業(yè)實現(xiàn)工業(yè)4.0以及未來實驗室至關(guān)重要。