諾和諾德公司的科學家已成功利用連續(xù)流技術(shù)，對半胱氨酸延伸多肽前體中的肽和蛋白質(zhì)進行C端α-胺化[1]?？傮w而言，該過程包含三個步驟：光標記取代半胱氨酸硫醇、光誘導脫羧消除和烯酰胺裂解。在配備光化學反應(yīng)器模塊的系列流動系統(tǒng)中，對重組制備的肽YY類似物進行了克級合成，而現(xiàn)有技術(shù)無法實現(xiàn)商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。

現(xiàn)代合成中的多肽治療學：機遇與局限

近年來，基于肽的療法經(jīng)歷了復(fù)興，這可能是由于化學和結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域的飛躍。此外，針對基于肽的療法的局限性，特別是與半衰期短和口服生物利用度差有關(guān)的局限性，最近的進展已經(jīng)脫穎而出 [2]。傳統(tǒng)上，肽是通過使用固相肽合成 （SPPS） 合成的，但當需要放大以滿足大批量需求時，這種方法可能不可行。在這種情況下，使用重組生產(chǎn)提供了一種替代方法。然而，使用這種方法制備含有 C 端 α-酰胺的肽特別具有挑戰(zhàn)性。

重組生產(chǎn)與光流相結(jié)合進行功能化

在這項工作中，基于 Baker 小組 [3] 先前的披露，C 端半胱氨酸殘基與光不穩(wěn)定試劑 4-氯-7-硝基苯并呋喃 （NBD-Cl） 偶聯(lián)。照射后，該中間體經(jīng)過脫羧-碎裂序列，得到 C 端 N-乙烯基酰胺。可以通過酸水解或反電子需求 Diels-Alder （IEDDA） 反應(yīng)去除乙烯基以揭示 C 端 α-酰胺，從而與對酸敏感的肽和蛋白質(zhì)（例如糖肽）兼容。在小規(guī)模 （250 μM） 上，該方案成功批量用于合成 GLP-1R 激動劑 GLP-1（7-36），這是一類重要治療肽的一個例子，包括已上市的藥物艾塞那肽和利西那肽，以及其他生物學相關(guān)靶標，包括胃泌素釋放肽、骨分泌素和布利韋肽。

使用 配備光化學反應(yīng)器模塊的流動系統(tǒng)，放大工藝被證明是有效的。一個例子展示了 PYY 類似物的制備，PYY 是一種參與食欲調(diào)節(jié)的酰胺化胃腸道激素 [4， 5]。使用 4 g 起始材料，將 C 端半胱氨酸與 NBD-Cl 反應(yīng)，然后在流速條件下（430 nm，24 W，99% 燈功率，2 mL 線圈，20 mL/min，t分辨率 = 6 秒）進行光引發(fā)切割。在一次最終純化后，使用磷酸對 N 末端進行酶消化并將酰胺轉(zhuǎn)化為所需的酰胺化肽，總產(chǎn)量為 20%。第二個示例顯示了 12 g 重組 81 個氨基酸 GLP1R-胰島淀粉樣蛋白R 共激動劑前體肽以 78% 的產(chǎn)率快速、干凈地轉(zhuǎn)化為目標肽酰胺。

總結(jié)

綜上所述，Harris 及其同事公開了一種高效方法，能夠?qū)㈦暮偷鞍踪|(zhì)快速且高產(chǎn)地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的 C 端酰胺。值得注意的是，這項工作使得 C 端酰胺化（光標記和光化學轉(zhuǎn)化）能夠在一天內(nèi)完成，這顯著提升了現(xiàn)有工藝水平。底物范圍廣泛，合成肽和重組肽均可耐受。作者指出，如果沒有 Vapourtec R 系列流動系統(tǒng)與 UV-150 光化學反應(yīng)器的結(jié)合，該反應(yīng)根本無法實現(xiàn)商業(yè)規(guī)模，這充分展現(xiàn)了使用賦能技術(shù)（尤其是流動光化學）的優(yōu)勢。

Photochemically-enabled, post-translational production of C-terminal amides. (D. Hymel, F. Wokcik, K. S. Halskov et al., Nature Comm., 2024, 15, 7162). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51005-5